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技術文章
Morris水迷宮實驗準則
目 錄
一、實驗原理（水迷宮的發展史，以及簡單的實驗原理和應用領域，以及在我國的發展情況和國內外的主要廠家）
二、Morris水迷宮的組成（主要分為硬件和圖像采集，軟件）
三、硬件準則（國內外文獻提及到的硬件準則，我們主要針對國內文獻提及到的）
四、實驗流程準則（實驗細節）
五、統計方法學準則（遵循統計學原理）
六、評價指標的準則（實驗數據的解釋）
七、實驗適用范圍準則（實驗適用四個領域，與水迷宮的10個優點）
八、實驗注意事項
以下準則僅供實驗參考，行為學實驗必須依據自身的實際課題來恰當安排實驗。
一、實驗原理
20世紀80年代初,英國的心理學家Morris和他的同事利用大鼠在盛有水和牛奶混合物的不透明水池中搜索目標物的方法,研究大鼠的海馬等腦區受到損害后的學習、記憶和空間定向以及認知能力時取得了令人矚目的結果。這種裝置不但構思新穎、實驗設計合理以及方法簡便和實用,而且便于觀察和記錄動物入水后搜索藏在水下平臺所需的時間、采用的策略和它們的游泳軌跡,從而可分析和推斷動物的學習、記憶和空間認知等方面的能力。雖然起初的實驗對象為大鼠，但此后該迷宮系統成為評估嚙齒類動物空間學習和記憶能力的經典程序，廣泛運用于神經生物學、藥理學等領域的基礎和應用研究中。它能較客觀地衡量動物空間記憶、工作記憶以及空間辨別能力的改變。因此,這種研究方法很快就引起各國神經科學家的關注,并將此法稱為Morris水迷宮法。國外有許多生產Morris水迷宮的公司，比如說德國的TSE公司，美國的Sandiegoinstruments公司、德國Biobserve公司等等；20世紀80年代末,中國科學院心理研究所建立了我國di一個Morris水迷宮實驗室,并于90年代初建立了Morris水迷宮圖像自動采集和處理系統。國內隨后出現了許多Morris水迷宮生產廠家，比如說有上海洛維、上海欣軟等等，但是從到國內，Morris水迷宮的硬件設備，軟件系統，實驗方法，以及實驗數據的處理方法都不盡相同，因此，從Morris水迷宮法的發明到現在已有20余年的歷史了，應該制定一套比較標準的實驗準則了。
二、Morris水迷宮的組成
Morris實驗系統由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統組成。
1、Morris水迷宮裝置:主要由盛水的水池和一個可調節高度和可移動位置的站臺所組成。
2、水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統:該系統的主要部件為攝像機、計算機和圖像采集卡等。這種系統有多種型號,但工作原理和流程大致相似:攝像頭采集大鼠游泳圖像(模擬信號)輸入到計算機中的圖像采集卡進行模/數轉換,大鼠游泳的模擬圖像轉化為數字圖像儲存于硬盤中,將數字圖像進行圖像分析得到有關的測試參數。軟件分析系統能自動地采集動物的入水位置、游泳的速度、搜索目標等所需時間、運行軌跡和搜索策略等參數,并可將所采集的各種資料進行統計和分析。
三、硬件準則要求
1、水池和站臺：對于水池的大小，存在一個人為選擇的問題，看起來應該統一標準，其實并不容易。但是有個原則就是水池不能太小，站臺也不能太大。Morris初（1981年）用于大鼠的水池是直徑1.32米、高為0.6米，水池的水深為0.40米;但后來（1984年）改為直徑2.14米、高0.4米，水池的水深為0.25米。對于小鼠的實驗水池，文獻中介紹的迷宮直徑差異巨大，小到0.6米, 大到2.0米。一般而言，過小的水池使小鼠爬上平臺的偶然性增加，任務難度減小。過大的水池會使小鼠游泳路徑延長，體力消耗過大，爬上站臺的機率減少。現在國內文獻中所用水迷宮水池大多數為大鼠1.6m或1.8m居多，而小鼠一般為1m或1.2m，高0.5m。站臺一般為圓形，直徑可分為大鼠12cm,小鼠6cm,表面粗糙，高度一般為30cm。國外文獻中所用水迷宮水池大多數為大鼠1.8m或2.0m居多，高0.6m,站臺直徑10cm；而小鼠一般為1m到1.5m，高0.3m站臺直徑5cm。國內尺寸能統一么？如何定標準？
四、實驗流程準則
Morris水迷宮實驗主要測定空間學習記憶能力，主要的實驗內容有隱蔽站臺試驗、空間探索試驗、反向試驗和可視站臺試驗等。在這里主要介紹下文獻里面主要做的隱蔽站臺試驗和空間探索試驗的流程準則。
隱蔽站臺試驗：
嚙齒類動物di一次游泳時,一般不會找到藏于水面下的不可見的站臺。若動物在入水游泳60～90s以內仍未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺時,實驗人員可將動物引導置于站臺上站立10～30s,使動物體會站在站臺上的感覺,這樣從第二次開始,學習成績就能迅速提高。動物爬上站臺后,讓動物在站臺上站立5～10s。將大鼠從站臺上拿下來,休息30～60s以后再進行下一次訓練。在一般情況下,正常大鼠在經過4～6個實驗日訓練后,很快就學會以zui快zui佳的軌跡搜索到站臺的確切位置。
每天開始時，將鼠任意從四個象限（東北、西北、東南、西南）之一面向池壁放入水中，站臺放置于東南象限， 每次實驗鼠共游泳60～90s來尋找隱藏的站臺。如果成功地找到站臺，鼠可以得到在站臺上的10～30s休息時間；如果60～90s內未能成功的找到站臺，就由實驗人員將鼠人工置于站臺上，且同樣給予10～30s的休息時間。有時鼠可能會在10～30s間隔時間到達之前從站臺上掉下或跳入水中繼續游泳。一旦這種情況發生，則將鼠重新放回站臺，并重新計時，使時間間隔到達（10～30s）。這樣可以確保每只鼠在每次實驗后有相等的時間來觀察和獲取空間信息。
空間探索試驗：
隱蔽站臺試驗結束24h后，撤除站臺。然后任選一相同入水點將鼠放入水中，記錄鼠在60s或120s內的游泳路徑，記錄鼠在原站臺象限的停留時間和穿越原站臺次數，觀察受試鼠的空間定位能力，及在空間探索過程中的變化規律。在電腦屏幕上用圓形環標記出站臺原所在位置，這樣可以記錄穿越原站臺所在位置的次數。
實驗流程準則：
五、統計方法學準則
潛伏期時間為計量資料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。計數資料，比如說穿越站臺的次數，可用X2檢驗，四格表總例數小于40，或總例數等于或大于40但出現理論數等于或小于1時，應改用確切概率法。
Morris 水迷宮的實驗數據較為復雜，其統計分析難度也較大，尤其是對大鼠在尋找隱蔽站臺試驗中所測得的逃避潛伏期如何進行統計學分析既往存在的問題較多。在過去的研究中，國內文獻中有的直接計算每天的平均逃避潛伏期后再進行t檢驗或方差分析，或根據大鼠的逃避潛伏期在定位航行試驗后3d趨于穩定的情況，僅對后3d的平均逃避潛伏期進行t檢驗或方差分析。有的研究則就1～5d的逃避潛伏期進行單因素方差分析。我們認為以上統計方法均不正確。一個較明顯的錯誤是，以趨于平穩的后3d的平均逃避潛伏期代表記憶水平，首先遇到的問題是僅在生理狀態下的大鼠才表現如此，而實驗記憶損傷組大鼠往往后3d的逃避潛伏期仍然持續下降。正常青年組和初老年組大鼠的逃避潛伏期在后3d趨于平穩，但實驗損傷組大鼠的逃避潛伏期由于學習記憶損傷后其基線較高，第3～5天逃避潛伏期仍然呈下降的趨勢，并不象正常對照組一樣趨于穩定。不僅如此，還存在上述統計方法對隱蔽站臺試驗中測得的逃避潛伏期數據統計學特征的認識錯誤。隱蔽站臺試驗中的逃避潛伏期具有以下特點：①系重復測量設計，即在給予某種處理后，在不同的時間點上從同一受試對象上重復測量獲得的數據(逃避潛伏期)；②影響逃避潛伏期(自變量)統計分析結果的至少有動物組別、檢測時點等多個效應因子，效應因子之間存在交互影響效應；③同一受試動物的不同時間點所測得的逃避潛伏期存在高度的自相關性；④存在截尾數據(大潛伏期)。據此，對Morris水迷宮中隱蔽站臺試驗的逃避潛伏期應采用重復測量數據repeated measures analyses of variance(ANOVA)的多因素方差分析結合截尾數據的生存分析方法較為恰當，國外文獻報道中常用，這種方法對潛伏期均值進行進一步的分析，天數作為自變量，潛伏期或游泳速度作為因變量。
六、評價指標的準則（指標僅供參考，不同的軟件參數名稱不同）
雖然文獻中提到了紛繁復雜的評價指標，但對這些指標并沒有進行很好的特征化和準則化。例如，游泳速度明顯是運動能力的指標，路徑長度又受游泳速度和游泳時間（潛伏期）的雙重影響，理論上不應該是判斷認知能力的很好指標。所以，對各項指標所反映的行為性質需要進行探討，解釋這些指標時要慎重。單用潛伏期作為指標并不能提供有關空間學習的足夠信息，因為游泳速度快也并非意味著學習效率就高，記憶能力就好。
參數定義準則：
總路程（總活動度）：實驗動物總的運動路程；
與動物自身的游泳速度直接相關，在相同的時間內，只反映動物的游泳速度的快慢；即路程越長，反映了動物的游泳速度越快。
總時間：開始錄像到錄像結束的總觀察時間；
即為單次的訓練時間，一般現在為60s;
平均速度：總路程/總時間；
從中可以看出動物游泳速度的個體差異來，動物的潛伏期和游泳速度有一定的關系；
上臺時間（潛伏期）：指實驗動物每次入水后di一次成功找到站臺所需的時間；成功上臺是指在臺上逗留時間超過5～10秒鐘（可自己定義），如果逗留時間不足5～10秒，則不算上臺，潛伏期時間即為訓練時間；
潛伏期是morris水迷宮一個很重要的參照指標，它的時間長短也代表著動物空間學習記憶能力的好壞，潛伏期短，預示著動物的學習記憶能力好；但是和動物自身的游泳速度有關，比如有的正常大鼠游泳速度慢些，所以潛伏期比癡呆組動物還長，另外，某些動物放入水中后會左右觀望打圈，或者原地不動確定方向后直接游到臺上，出現這種現象，說明動物記憶力好，這個現象是很重要的，如果在治療組動物發現這種情況，是非常好的。但是由于動物原地不動，這個時候潛伏期的時間可能會長，所以潛伏期并不能作為判斷記憶力好壞的終指標。
上臺前路程：指實驗動物在di一次成功上臺前所運動的路程；
與潛伏期時間相關，潛伏期時間越長，上臺前路程也就越大；二者之間呈正相關系，所以也間接反映了潛伏期時間的長短，也可以看做是評定動物記憶力好壞的指標之一。
上臺前平均速度：上臺前路程/上臺時間；
從中可以看出動物游泳速度的個體差異來，動物的潛伏期和游泳速度有一定的關系；
di一象限活動路程：實驗動物在di一象限所活動的距離之和；
di一象限活動時間：實驗動物在di一象限運動的時間之和；
第二象限活動路程：實驗動物在第二象限所活動的距離之和；
第二象限活動時間：實驗動物在第二象限運動的時間之和；
第三象限活動路程：實驗動物在第三象限所活動的距離之和；
由于站臺一般都放置在第三象限，在這個象限活動的路程越長，反映了動物的空間記憶能力比較好；
第三象限活動時間：實驗動物在第三象限運動的時間之和；
由于站臺一般都放置在第三象限，在這個象限活動的時間越長，反映了動物的空間記憶能力比較好；
第四象限活動路程：實驗動物在第四象限所活動的距離之和；
第四象限活動時間：實驗動物在第四象限運動的時間之和；
中心活動路程：實驗動物在水池中心區域內活動的距離之和；
嚙齒類動物游泳有繞邊性和邊緣性，而站臺是在遠離周邊靠近水池中心的，如果動物改變了游泳路線在水池中心區域內活動的路程長的話，反映其空間記憶能力好。
中心活動時間：實驗動物在水池中心區域內活動的時間之和；
嚙齒類動物游泳有繞邊性和邊緣性，而站臺是在遠離周邊靠近水池中心的，如果動物改變了游泳路線在水池中心區域內活動的時間長的話，反映其空間記憶能力好。
周圍活動路程：實驗動物在水池周邊區域內活動的距離之和；
嚙齒類動物游泳有繞邊性和邊緣性，而站臺是在遠離周邊靠近水池中心的，如果動物在水池周邊區域內活動的路程長的話，反映其空間記憶能力差。
周圍活動時間：實驗動物在水池周邊區域內活動的時間之和；
嚙齒類動物游泳有繞邊性和邊緣性，而站臺是在遠離周邊靠近水池中心的，如果動物在水池周邊區域內活動的時間長的話，反映其空間記憶能力差。
站臺周圍范圍I活動路程： 實驗動物在站臺周邊區域I內活動的距離之和；
站臺周圍范圍I活動時間：實驗動物在站臺周邊區域I內活動的時間之和；
站臺周圍范圍II活動路程：實驗動物在站臺周邊區域II內活動的距離之和；
站臺周圍范圍II活動時間：實驗動物在站臺周邊區域II內活動的時間之和；
站臺周圍范圍III活動路程：實驗動物在站臺周邊區域III內活動的距離之和；
站臺周圍范圍III活動時間：實驗動物在站臺周邊區域III內活動的時間之和；
站臺周圍范圍IV活動路程：實驗動物在站臺周邊區域IV內活動的距離之和；
站臺周圍范圍IV活動時間：實驗動物在站臺周邊區域IV內活動的時間之和；
在站臺周圍范圍活動的路程和時間越長，反映了動物的空間記憶能力好。
站臺穿越次數：指在撤去平臺后，在一定的時間內，實驗動物穿越原站臺位置的次數。（穿越一次指進出站臺區域各一次）；
在一定的時間內，動物穿越原站臺位置的次數越多，說明其空間學習記憶能力越好。
初始角(弧度)：指在將實驗動物放入水池后，動物的運動軌跡的起始點的切線與起始點和站臺中心連線之間的夾角；
如果初始角的角度越小，說明動物記得站臺的位置，直接向站臺方向游，反映空間學習記憶能力比較好。
入水點象限：實驗動物入水時所處的象限；
搜索策略：
搜索策略和趨觸性是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的兩個指標。大鼠尋找平臺的方式大致可分為四種：邊緣式、隨機式、趨向式及直線式。不同的搜索方式代表大鼠以不同的策略尋找平臺，正常動物的搜索策略隨著訓練次數的增加而呈現“邊緣式→隨機式→趨向式→直線式”的變化規律。癡呆動物的搜索策略會發生異常變化。比如只有邊緣式→隨機式，或者隨機式→邊緣式，趨向式和直線式比較少見。
七、實驗適用范圍準則
與其他方法相比，Morris水迷宮在判定嚙齒類動物認知功能中具有很多優點：（1）它不需要實驗前訓練階段，而且可以在短時間內完成相對大量的動物。（2）由于對年齡相關性空間記憶損害有可靠的敏感性，Morris水迷宮是判斷老年鼠空間學習記憶能力的特別有用的工具。通過探測和轉移位置實驗的訓練，學習和回憶過程可以被記錄分析，也可以在各組之間比較。（3）雖然對于鼠類來說浸入水中是令其厭惡的，驅動動物逃避的是水刺激，而不需要食物剝奪和電擊，因此，避免了剝奪食物給實驗動物帶來的新陳代謝和電擊休克方面的問題，而這方面問題對某些品系的動物來說可能是危險的。（4）氣味或痕跡等干擾可以被去除。（5）將實驗動物的學習記憶障礙和感覺、運動缺陷等分離開來，減少它們對學習記憶過程檢測的干擾。可見站臺實驗，可以識別可能影響實驗結果的動物視覺缺陷，修正標準Morris水迷宮實驗中得到的結果。（6）通過改變站臺的位置，可以完成學習和再學習實驗，相應的，在同組動物中也可以測量不同用藥量的效果。（7）既可以檢測空間參考記憶又可以檢測空間工作記憶。在用固定平臺測試小鼠的空間參考記憶后再將平臺的位置改為不固定，就可檢測它們的工作記憶能力（8）通過使用窗簾、劃分區域等，可以減少實驗人員和實驗以外的物體對視頻跟蹤系統記錄的干擾。（9）能提供較多的實驗參數，系統全面地考察實驗動物空間認知加工的過程，客觀地反映其認知水平，顯然，尋找不固定平臺的認知過程要復雜一些，需要動物對時間和空間上的分離信息加以整合和判斷。（10）操作簡便，數據誤差較小。
1．對比食物驅動的模型（如放射臂迷宮），水迷宮實驗的zui大優點在于，動物具有更大的、逃離水環境的動機。而且不必禁食，特別適合老年動物的測試。加上它對衰老引起的記憶減弱尤其敏感，因此，水迷宮zui常用于老年動物記憶的研究。
2．如用小鼠，除游泳池尺寸約為大鼠的50%以外，平臺直徑也較少（7.5cm）。實驗方法與大鼠類似，但訓練周期較短。一般獲得性訓練3天共訓16次（di一天4次，后兩天每天6次；兩次訓練之間的間隔5~10min，第四天為探查訓練，第五、六天為對位訓練，每天訓練六次，第七天為第二次探查訓練。
3.如用肉眼觀察，在所有試驗過程中試驗著始終坐在同一位置，距離泳池近的邊緣約60cm。
4．每天在固定時間測試。操作輕柔，避免不必要的應激刺激。
5．當與其他同類實驗相比較時，要注意到動物的性別、品系、泳池的尺寸和水溫等多種因素對實驗結果的影響。此外，當以游泳速度作為觀察指標時，要考慮到動物的體重、年齡以及骨骼肌發育狀況等對游泳速度可能造成影響。
6．用老年動物進行實驗時，應確認動物的游泳能力和視力不因年齡增大而影響行為操作。其方法如下：將平臺露出水面以使動物能夠看見平臺。動物放入泳池后如毫無困難地直接游向平臺，說明動物的游泳能力和視力均正常，可以開始實驗。
7．游泳對動物是一個較大的應激刺激，可引起神經內分泌的變化。這些變化可能對實驗結果造成干擾。對老年動物，嚴重時可誘發心血管疾病而導致卒中甚至死亡。因此，必要時可將動物多次放入泳池或適當延長其游泳時間以增加動物對游泳的適應能力。
8．當用牛奶或奶粉攪渾泳池的水時，要定期換水以免水fu敗變質；
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